SP法雙重染色步驟
1～6步驟與SABC法相同，但無需使用生物素阻斷劑：
7．切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C孵育后，PBS沖洗3次，每次5分鐘
8.滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘；
9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
10．堿性磷酸酶顯色液（BCIP／NBT）顯色（紫藍色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘；
11．滴加0．05％鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）；
12．滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37~C孵育10分鐘；
13．滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體），4~C孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘；
14．滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：
15．滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
16．過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘
17．蘇木精復染細胞核；
18．水溶性封片劑封片。
在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設計。購買免疫組化雙染試劑盒時；應選擇與設計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應避免定位在細胞的同一部位（如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，選擇免疫熒光組織細胞化學雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光），它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認陽性結(jié)果。
在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預實驗，預實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預實驗結(jié)果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。
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